動(dòng)物腫瘤（臟器）組織巨噬細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0052SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
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名稱
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產(chǎn)品編號(hào)
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規(guī)格
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A
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分離液 1
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200ml
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B
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分離液 2
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200ml
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C
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樣本稀釋液（贈(zèng)品）
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2010C1119
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200ml
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D
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清洗液（贈(zèng)品）
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2010X1118
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200ml
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E
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F 液（贈(zèng)品）
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F2013TBD
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200ml
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F
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說明書
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1 份
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【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
適用儀器：*大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
【檢驗(yàn)方法】
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
1. 首先制備組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)（文檔編號(hào)：TBD0004SOP）”。
2. 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量*少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
3. 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 25min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)， 具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*佳分離效果）。
4. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。**層為稀釋液層。**層為環(huán)狀乳白色巨 噬細(xì)胞層（**層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán) 狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及**層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。
5. 用吸管小心吸取**層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
6. 250g，離心 10min。
7. 棄上清。
8. 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
9. 250g，離心 10min。
10. 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
分離圖例：
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
（1）用巨噬細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180029）或巨噬細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào) TBD20180059）以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì) 胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
（4）不貼壁的為**細(xì)胞。
注：
a) 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。
b) 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。
c) 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選 用**磁珠陽(yáng)性或陰性分選。
【注意事項(xiàng)】
1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，*好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效 果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 本實(shí)驗(yàn)*好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞 貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3. 吸取過多的乳白色細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
4. 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí)，分離效果更佳。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染**，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分 離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
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紅細(xì)胞
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白細(xì)胞
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血小板
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（4.0-10.0）×109
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含量（個(gè)/L）
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（4.0-5.5）×1012
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中性粒細(xì)胞
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**細(xì)胞
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單核細(xì)胞
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（1.0-3.0）×1011
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50%-70%
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20%-40%
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3%-8%
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【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
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1. 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
2. 所獲得巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3. 所獲得巨噬細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
4. 所獲得巨噬細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.**組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
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出現(xiàn)情況
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出現(xiàn)原因
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建議解決方案
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離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層
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轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短
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適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
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離心后目的細(xì)胞存在于分離液中
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轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)
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離心后白環(huán)層彌散
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細(xì)胞密度過大
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調(diào)整細(xì)胞密度
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離心后白環(huán)層太淺或看不見
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細(xì)胞密度過小
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2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3. 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*佳分離效果，
離心力*小不得小于 400g，*大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。