一、 細(xì)胞培養(yǎng)基的概念和原理
細(xì)胞培養(yǎng)基是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。培養(yǎng)液或培養(yǎng)基的含義幾乎相同，英文都是medium。當(dāng)它是粉劑時(shí)，傾向性地稱(chēng)為培養(yǎng)基，而將粉劑配成液體后，多稱(chēng)為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中常常補(bǔ)加血清、***等成分。培養(yǎng)基主要包括天然細(xì)胞培養(yǎng)基、合成細(xì)胞培養(yǎng)基和無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基等。
天然細(xì)胞培養(yǎng)基是人們?cè)缙诓捎玫募?xì)胞培養(yǎng)基，直接取自于動(dòng)物組織提取液或體液，如血漿凝塊、血清、**液、胚胎浸出液等。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，但成分復(fù)雜，差異大、不穩(wěn)定，來(lái)源也受到限制。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基，富含氨基酸。血清是天然培養(yǎng)基中*有效和*常用的培養(yǎng)基，但其組成成分復(fù)雜，其中一些成分與功能不明確。血清的來(lái)源有胎牛血清、小牛或成牛血清、馬血清、雞血清、羊血清及人血清，*廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和小牛血清。
合成細(xì)胞培養(yǎng)基是用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，主要包括糖類(lèi)、必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等。自1950 年199 細(xì)胞培養(yǎng)基問(wèn)世以來(lái)，合成細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展至今已有幾十種，除了沿用半個(gè)世紀(jì)的基礎(chǔ)合成細(xì)胞培養(yǎng)基之外，近年來(lái)還出現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富的低血清細(xì)胞培養(yǎng)基。由于細(xì)胞種類(lèi)和培養(yǎng)條件不同，適宜的合成細(xì)胞培養(yǎng)基也不同，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中*常用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。由于天然培養(yǎng)基的一些營(yíng)養(yǎng)成分不能被合成細(xì)胞培養(yǎng)基完全代替，因此一般需在合成細(xì)胞培養(yǎng)基中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)非常有效，但小牛血清的成分復(fù)雜，這對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化和檢測(cè)會(huì)帶來(lái)一定的不便，為減少小牛血清的影響，開(kāi)發(fā)了營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富的低血清細(xì)胞培養(yǎng)基，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％。
無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（serum free medium， SFM）是指在使用中無(wú)需添加血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，且其組成成分不含有任何動(dòng)物組分。按照其組分分類(lèi)，還可以分為無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基和化學(xué)限定無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，前者組分中可能含有某些植物來(lái)源成分，而后者完全由化學(xué)成分明確的組分組成。其中，無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基是目前在生物制藥行業(yè)中應(yīng)用*廣泛的，它提高了細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來(lái)的麻煩。目前，已有多種無(wú)血清培養(yǎng)基上市，如雜交瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和NS0 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基等。無(wú)血清培養(yǎng)基通常添加生長(zhǎng)附加成分，如**與生長(zhǎng)因子、低分子營(yíng)養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)鐵蛋白等促細(xì)胞生長(zhǎng)的附加成分，一般包括胰島素、孕酮、硒酸鈉、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。
細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，它為動(dòng)物細(xì)胞的健康快速成長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所以只要用到細(xì)胞來(lái)制造生物技術(shù)產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)基的重要作用就無(wú)可替代。
二、細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)與基本成分
2.1 天然培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基是指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類(lèi)培養(yǎng)基，如血漿、血清、**液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過(guò)程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸被合成培養(yǎng)基所替代。
2.1.1 小牛血清
用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因主要是來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)*高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分*少。牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。牛血清中含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。
1) 血清主要作用
(1) 提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類(lèi)物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。
(2) 提供**和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)**（氫化可的松、地塞米松）、類(lèi)固醇**（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。
(3) 提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及**等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用。
(4) 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷，對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。
2) 優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)
血清是非常復(fù)雜的混合物，成分多樣，含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子，有的對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，如含有攜帶**、礦物質(zhì)、微量元素和脂類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。血清能夠提供細(xì)胞貼壁因子和擴(kuò)散因子。血清中含有起穩(wěn)定作用和**的因子，能夠維持培養(yǎng)基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但是血清的加入也帶來(lái)了很多問(wèn)題：
(1) 血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子、**和脂類(lèi)等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來(lái)許多困難；
(2) 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；
(3) 不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。
(4) 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷**以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長(zhǎng)（成纖維細(xì)胞）同時(shí)抑制另一類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)（表皮細(xì)胞）。
(5) 血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、****等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。
(6) 取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。
(7) 血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
(8) 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成生產(chǎn)成本的主要部分之一。
(9) 為了使與傳染源相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)減少到*低，存在多個(gè)國(guó)家間限制進(jìn)出口生物材料的國(guó)際法規(guī)。
2.1.2 水解乳蛋白
水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于**微生物培養(yǎng)，又可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中一般為0.5％水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養(yǎng)基（如MEM）按1:1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于低鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。首先由于水解乳蛋白系或者制品帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。其次水解乳蛋白及含有動(dòng)物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復(fù)雜，這對(duì)于蛋白質(zhì)**顯得更加重要。因?yàn)閺膭?dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)生物藥品，其面臨的*大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，像動(dòng)物肽類(lèi)物質(zhì)的引入，勢(shì)必會(huì)增加提取、分離、純化的步驟，一方面使成本提高，另一方面也會(huì)影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。
2.2平衡鹽溶液
平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS ）簡(jiǎn)稱(chēng)鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度、同時(shí)供給細(xì)胞生存所必需的能量和無(wú)機(jī)離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統(tǒng)有所不同，其中以Hank’s液和Earle’s液為例，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hank’s液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Earle’s液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hank’s液就可以了。
一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細(xì)胞膜的重要組成成分，同時(shí)參與許多重要的細(xì)胞功能活動(dòng)。但它們有使細(xì)胞凝集的作用，在配制分散細(xì)胞的消化液和特殊用途的細(xì)胞洗滌時(shí)，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。
2.3基礎(chǔ)培養(yǎng)基
2.3.1 概述
基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加一定量的血清使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。
2.3.2 組成及作用
氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細(xì)胞可以自己合成，或通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)。絕大部分細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，因?yàn)楣劝滨０肥亲鳛槟茉?
及碳源物質(zhì)同時(shí)被細(xì)胞利用，是是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)**而死亡，所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細(xì)胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體，D型氨基酸不能被利用。
維生素：維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞代謝有重大作用。它們?cè)诩?xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒(méi)有它們，酶便沒(méi)有活性，代謝活動(dòng)將無(wú)法進(jìn)行。維生素分為水溶和脂溶兩大類(lèi)，的培養(yǎng)液中直接采用ATP和輔酶A。
葡萄糖：大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來(lái)源之一。
無(wú)機(jī)鹽：維持培養(yǎng)基滲透壓平衡，參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細(xì)胞外液中*主要的陽(yáng)離子，對(duì)維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)K+對(duì)于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時(shí)，為了減少細(xì)胞的聚集和附著，要減少Ca2+的濃度。Mg2+是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，對(duì)于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控有重要作用。
其他成分：肽、核苷、嘌呤等?？蓭椭?xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。