動物骨髓單個核細胞分離液實驗方法
技術文檔編號：TBD0024SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
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名稱
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產(chǎn)品編號
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規(guī)格
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A
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XXXX 動物骨髓單個核細胞分離液
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200ml
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B
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樣本稀釋液（贈品）
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2010C1119
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200ml
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C
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清洗液（贈品）
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2010X1118
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200ml
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D
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勻漿沖洗液（贈品）
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F2013TBD
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200ml
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E
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說明書
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1 份
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【實驗前準備】
1. 適用儀器
*大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機
2. 無菌硅化離心管
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序號
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產(chǎn)品名稱
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產(chǎn)品貨號
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規(guī)格
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1
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無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支）
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TUB2015
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100 支/包
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【骨髓單細胞懸液的制備】
1. 以適當方式處死動物，剝離出股骨或脛骨，用剪刀剪斷骨頭兩端，露出內(nèi)腔。
2. 用注射器吸取適量（根據(jù)動物大小）的勻漿沖洗液（產(chǎn)品編號：F2013TBD）沖洗出內(nèi)腔中的骨髓。
3. 收集懸液到合適離心管中，反復吹打成單細胞懸液，以 70μm 細胞篩網(wǎng)（產(chǎn)品編號：TBDTM-SC，隨試劑盒附贈 5 個）過濾。
4. 450g，離心 10min，棄上清。
5. 用樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）重懸細胞濃度為 2×108–1×109/ml 的單細胞懸液
備用（以小鼠為例，一般使用 1ml 樣本稀釋液重懸骨髓細胞）。
【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
1. 取一支適當離心管，加入與骨髓單細胞懸液等量的分離液（注：分離液*少不得少于
3ml）。
2. 用吸管小心吸取骨髓單細胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min。（注：根據(jù)骨髓單細胞懸液量確定離心條件，骨髓單細胞懸液量越大，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*佳分離效果）。
3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。**層為稀釋液層。**層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4. 用吸管小心吸取**層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。
分離圖例
【注意事項】
1. 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得*佳的實驗結果，*好在取樣 2h 內(nèi)進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2. 本實驗*好不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。
3. 吸取過多的單個核細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。
4. 分離液用量大于骨髓單細胞懸液樣本時，分離效果更佳。
5. 如實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系天津灝洋技術支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染**，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗單個核細胞提取率及純度大于 80%。
【相關實驗技術方案】
1. 骨髓沖洗單細胞懸液制備技術。
2. 所獲得單個核細胞的培養(yǎng)技術。
3. 所獲得單個核細胞的核酸提取技術。
4. 所獲得單個核細胞的鑒定方法A.流式細胞技術B.**組化技術
C.原位雜交技術
D.PCR 技術
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
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出現(xiàn)情況
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出現(xiàn)原因
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建議解決方案
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離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層
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轉速過小或離心時間過短
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適當增減轉速
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離心后目的細胞存在于分離液中
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轉速過大或離心時間過長
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離心后白環(huán)層彌散
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細胞密度過大
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調(diào)整細胞密度
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離心后白環(huán)層太淺或看不見
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細胞密度過小
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2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉速進行調(diào)整。
3. 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到*佳分離效果，離心力*小不得小于 400g，*大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。