動物骨髓單個核細胞分離液實驗方法
技術(shù)文檔編號：TBD0024SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
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名稱
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產(chǎn)品編號
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規(guī)格
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A
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XXXX 動物骨髓單個核細胞分離液
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200ml
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B
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樣本稀釋液（贈品）
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2010C1119
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200ml
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C
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清洗液（贈品）
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2010X1118
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200ml
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D
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勻漿沖洗液（贈品）
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F2013TBD
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200ml
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E
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說明書
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1 份
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【實驗前準備】
1. 適用儀器
*大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
2. 無菌硅化離心管
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序號
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產(chǎn)品名稱
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產(chǎn)品貨號
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規(guī)格
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1
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無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支）
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TUB2015
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100 支/包
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【骨髓單細胞懸液的制備】
1. 以適當方式處死動物，剝離出股骨或脛骨，用剪刀剪斷骨頭兩端，露出內(nèi)腔。
2. 用注射器吸取適量（根據(jù)動物大小）的勻漿沖洗液（產(chǎn)品編號：F2013TBD）沖洗出內(nèi)腔中的骨髓。
3. 收集懸液到合適離心管中，反復(fù)吹打成單細胞懸液，以 70μm 細胞篩網(wǎng)（產(chǎn)品編號：TBDTM-SC，隨試劑盒附贈 5 個）過濾。
4. 450g，離心 10min，棄上清。
5. 用樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）重懸細胞濃度為 2×108–1×109/ml 的單細胞懸液
備用（以小鼠為例，一般使用 1ml 樣本稀釋液重懸骨髓細胞）。
【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
1. 取一支適當離心管，加入與骨髓單細胞懸液等量的分離液（注：分離液*少不得少于
3ml）。
2. 用吸管小心吸取骨髓單細胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min。（注：根據(jù)骨髓單細胞懸液量確定離心條件，骨髓單細胞懸液量越大，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*佳分離效果）。
3. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。**層為稀釋液層。**層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4. 用吸管小心吸取**層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
分離圖例
【注意事項】
1. 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得*佳的實驗結(jié)果，*好在取樣 2h 內(nèi)進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2. 本實驗*好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。
3. 吸取過多的單個核細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。
4. 分離液用量大于骨髓單細胞懸液樣本時，分離效果更佳。
5. 如實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系天津灝洋技術(shù)支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染**，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗單個核細胞提取率及純度大于 80%。
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
1. 骨髓沖洗單細胞懸液制備技術(shù)。
2. 所獲得單個核細胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3. 所獲得單個核細胞的核酸提取技術(shù)。
4. 所獲得單個核細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.**組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
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出現(xiàn)情況
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出現(xiàn)原因
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建議解決方案
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離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層
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轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短
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適當增減轉(zhuǎn)速
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離心后目的細胞存在于分離液中
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轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
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離心后白環(huán)層彌散
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細胞密度過大
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調(diào)整細胞密度
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離心后白環(huán)層太淺或看不見
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細胞密度過小
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2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。
3. 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到*佳分離效果，離心力*小不得小于 400g，*大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。