BCA 蛋白定量試劑盒
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。
BCA 法快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對(duì)不同種類(lèi)蛋白質(zhì)檢測(cè)的變異系數(shù)非常小。BCA 法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞蛋白提取過(guò)程中，常用濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但受螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類(lèi)的影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
產(chǎn)品組成：
|
產(chǎn)品組成
|
301001（250 assays）
|
301002(1000 assays)
|
|
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)
|
0.5ml
|
2ml
|
|
|
50ml
|
200ml
|
|
BCA試劑B
|
1ml
|
4ml
|
使用方法：
A． 96孔酶標(biāo)板測(cè)定：
1. BCA工作液配制。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5ml
BCA試劑A加100μlBCA試劑B，混勻，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5ml
BCA試劑A加100μlBCA試劑B，混勻，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5ml
BCA試劑A加100μlBCA試劑B，混勻，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取一塊酶標(biāo)板，按以下表格數(shù)據(jù)加入試劑：
|
孔號(hào)
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
|
蛋白標(biāo)準(zhǔn)（ml）
|
0
|
1
|
2
|
4
|
8
|
12
|
16
|
20
|
|
去離子水（ml）
|
20
|
19
|
18
|
16
|
12
|
8
|
4
|
0
|
|
BCA工作液（ml）
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
|
對(duì)應(yīng)的蛋白含量（mg）
|
0
|
1
|
2
|
4
|
8
|
12
|
16
|
20
|
3. 振蕩混勻后，37℃放置30分鐘。
4. 用酶標(biāo)儀測(cè)定A562，以不含BSA的光吸收值為空白對(duì)照。
5. 以蛋白含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6. 樣品測(cè)定：將待測(cè)蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取20ml樣品，加入200ml BCA工作液，混勻后37℃放置30分鐘，然后以0號(hào)孔為對(duì)照，測(cè)定樣品吸收值A(chǔ)562。
7. 根據(jù)測(cè)得的吸收值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得樣品的蛋白含量。
8. 計(jì)算蛋白濃度：以查得的蛋白含量除以樣品體積20ml，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到待測(cè)樣品的實(shí)際濃度。
B． 比色皿測(cè)定
按照比色皿規(guī)格，與以上方法相同，適當(dāng)按比例增加各溶液體積即可。
儲(chǔ)存條件：
BCA試劑室溫保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)-20°C保存。
注意事項(xiàng)：
1. 在低溫條件或長(zhǎng)期保存出現(xiàn)沉淀時(shí)，可攪拌或37℃溫育使溶解, 如發(fā)現(xiàn)**污染則應(yīng)丟棄。
2. 因?yàn)锽CA法測(cè)定時(shí)顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非**控制顯色反應(yīng) 的時(shí)間和溫度，否則如需**測(cè)定，每次測(cè)定都需重做標(biāo)準(zhǔn)曲線。若需得到更為**的蛋白濃度結(jié)果，每個(gè)蛋白梯度和樣品均需做復(fù)孔。
3. 若測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色 沒(méi)有明顯變化，原因可能是樣品中含有嚴(yán)重干擾BCA法測(cè)定蛋白濃度的物質(zhì)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)樣品中各種物質(zhì)詳細(xì)的兼容性，參見(jiàn)附件BCA蛋白濃度測(cè)定兼容性表。
4. 試劑A 與試劑B 用應(yīng)密閉保存。
5. 當(dāng)試劑A 和B 混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失。
6. 使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水份蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。
附表：
|
以下是不干擾BCA方法測(cè)定的物質(zhì)濃度：
|
|
成分
|
相容濃度
|
成分
|
相容濃度
|
|
NP-40
|
5.0%
|
葡萄糖
|
10mM
|
|
Emulgen
|
1.0%
|
EDTA
|
10mM
|
|
Hepes
|
100mM
|
Sodium Chloride
|
1.0M
|
|
DTT
|
1mM
|
NaOH
|
0.1M
|
|
Guanidine?HCl
|
4.0M
|
Ammonium Sulfate
|
1.5M
|
|
Triton X-100
|
5.0%
|
乙酸鈉 pH 5.5
|
200mM
|
|
辛基糖苷
|
5.0%
|
SDS
|
5.0%
|
|
Urea
|
3.0M
|
Brij-35
|
5.0%
|
|
蔗糖
|
40%
|
Lubrol
|
1.0%
|
|
Glycine, pH 2.8
|
100mM
|
CHAPS
|
5.0%
|